地址：中国江苏南京永智路6号中国云计算基地B座F06
电话：17768119489
邮箱：2216681997@QQ.Com
网址：http://www.eternal-fei.com/
时间：2020-08-24 17:30:20 浏览次数：0次
本产品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂，将热启动Taq DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I等试剂预混成即用的2x Mix，可对目标cDNA进行快速并具有高特异性的定量检测。本产品采用化学修饰的Hot Start Taq DNA聚合酶，在 50 ℃以下无活性，只有 95 ℃条件下加热后才能完全恢复酶的活力，最大限度减少非特异性扩增产物的产生，提高荧光定量PCR反应的精确性。该试剂盒独特的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。
产品组分：
|
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
|
1 |
2×SYBR Green qPCR Mix |
5 x 1ml |
|
2 |
50×ROX Reference Dye |
1ml |
保存条件：
收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存，一年有效，2～8℃条件下储存6个月，避免反复多次冻融。
使用说明：
一、配制 Real-Time PCR反应体系：
1、将所有试剂2×SYBR Green qPCR Mix，ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，在室温下融解并彻底混匀，避免产生气泡。短暂离心后，置于冰上按照下表配制反应液。
参考下表配制反应体系：
|
组分 |
20ul体系 |
终浓度 |
|
SYBR Green qPCR Mix |
10μl |
1× |
|
Primer F (10 μM)* |
0.4~0.8 μl |
0.2~0.4 uM* |
|
Primer R (10 μM)* |
0.4~0.8 μl |
0.2~0.4 uM* |
|
50 x ROX Reference Dye** |
－ |
－ |
|
cDNA模板 |
－ |
-- |
|
RNase-Free ddH2O |
至20 μl |
－ |
* 一般来说反应体系中引物终浓度为0.2 uM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度0.2~0.4 uM范围内调整引物浓度。
** 几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度见下表：
|
仪器型号 |
使用浓度 |
|
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne/ StepOne Plus等 |
5× |
|
ABI 7500/7500 Fast、QuantStudio ® 3/5、QuantStudio 6/7 Flex、ViiA 7、Stratagene Mx3000P/Mx3005P和Mx4000等 |
1× |
|
Roche、Bio-Rad、Eppendorf等 |
无需添加 |
2、盖上或密封反应管/PCR板，轻轻混匀。短暂离心，确保所有组分都在管/板底。
二、进行Real-Time PCR反应
1、建议采用两步法PCR反应程序进行反应。
两步法反应程序:
|
步骤 |
温度 |
持续时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95℃ |
5min |
1 |
|
变性 |
95℃ |
10sec |
40 |
|
退火延伸数据采集 |
60℃ |
30sec |
40 |
|
熔解曲线分析 |
根据仪器推荐程序设置 |
||
若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应。
三步法反应程序:
|
步骤 |
温度 |
持续时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95℃ |
5min |
1 |
|
变性 |
95℃ |
10sec |
40 |
|
退火 |
50-60℃ |
30sec |
40 |
|
延伸数据采集 |
72℃ |
30sec |
40 |
|
熔解曲线分析 |
根据仪器推荐程序设置 |
||
2、上机检测：将反应体系置于荧光定量 PCR 仪中，运行程序收集数据并分析结果。
